基於眼見為憑(Seeing is believing)，越來越多國際期刊在接受論文刊登時，除了生理或生化實驗的數據，也要求細胞影像方面的實驗結果。一張好的細胞影像有如畫龍點睛，勝過千言萬語。拍攝樣品影像資料像其他生理、生化實驗一樣有三要素：首先需要好的實驗設計，其次是實驗過程着重每一個細節，最後是使用合適的顯微鏡系統拍下實驗結果。即使圖像需要量化分析，若是拍出品質不好的圖，也會嚴重影響軟體判讀，使得分析工作倍加困難，甚至無法分析。

    確保顯微鏡系統狀況良好，並根據使用者不同的實驗需求，建議使用核心內不同的顯微鏡設施，為本核心實驗室的首要工作。其次，核心管理員對於影像實驗在樣品製備、實驗設計、專業技術層面也接受使用者諮詢及相關教育訓練。除了顯微鏡硬體設備，核心內也提供不同影像分析軟體供使用者進行影像處理、量測分析，對於不熟悉軟、硬體操作者皆提供諮詢及教學。

    本核心提供之儀器、服務及各項操作規則詳見第一期台大醫學院第一共研電子報。期望顯微影像核心的服務能幫助使用者順利取得影像實驗成果。

                             黃呈彦  徐華蔓

一、使用顯微影像核心之顯微鏡須接受哪些訓練

     自100年10月份起，凡是新進人員欲使用第一共研顯微影像核心之顯微鏡，必須先上本核心所開辦之基礎顯微鏡課程，對顯微鏡之組成與成像原理具有一定概念。其後針對欲使用之儀器向核心管理員商借儀器操作教學影片，或是預約管理員進行一對一教學(需收費)，方可自行預約操作核心內任一開放使用之顯微鏡。

    看過儀器操作教學影片，首次上機者，必須管理員陪同操作(不收費，但是請事先知會管理員)，待管理員確定使用者自行操作無誤後，方可獨立操作機器。

二、影像核心完成區域網路架構

    影像核心已完成區域網路配線工程，凡核心內所拍攝的影像檔，除了以該機器的電腦進行光碟燒錄備份外，也可以將檔案傳輸至核心實驗室內部網域的離線電腦共用資料夾data center內，便能到離線電腦區以隨身(硬)碟存取檔案。

 就像所有的實驗設計一樣，顯微影像拍攝也需要對照組。沒有經過螢光標誌的細胞是一組，因為不同的細胞株本身就會有不同強度的自體螢光，或是玻片表面有塗佈幫助細胞黏附的介質也有可能造成比較強的背景值。若是實驗組有超過一組以上的螢光標誌，在一開始進行抗體梯度測試實驗時，就要先確定A蛋白的二次抗體不會標誌B蛋白的一次抗體，而B蛋白的二次抗體則不會標誌A蛋白的一次抗體，方可進行共染。除了共染之實驗組外，每次實驗都要準備單染(單一螢光染色)的對照組，以方便拍攝時確認無漏光問題。此外，實驗過程若細胞死亡，不管是因藥物或是乾死，背景螢光皆會增強，會影響實驗判讀，此時好的對照組(例如:未加藥組)就可以幫助我們判斷訊號真偽。其他不同樣品製備問題則分述於下：

一、關於玻片製作

    一般標準細胞樣品玻片製作，實驗首先將細胞種在蓋玻片上進行實驗，再進行固定、螢光標誌的動作，然後選擇正立顯微鏡觀察，但有些特殊狀況筆者想要提醒大家:有些使用者會將細胞種在載玻片或是細胞培養玻片(chamber slide)，或者樣品為數百毫米的生物組織、胚胎這些樣品因為厚度及不同工作距離需求的問題，有時只能以低倍率物鏡觀察，因此使用者常因對不到焦距將玻片擠破。除了樣品毀損，且掉落的碎玻璃常損傷鏡頭、聚光鏡。因此在選擇合適的顯微鏡及物鏡時不可不慎，特殊的樣品狀況請務必先至核心與顯微鏡技術人員進行諮詢。

    封片時，首先要注意種有細胞那一面要確實封入封片膠內，若是放錯面則前功盡棄。有些實驗室使用不會硬化的水性封片膠，蓋玻片很容易滑動，若是滑動易造成樣品位置改變、擠壓或細胞捲起變形，久置後封片膠也會向內乾化。因此我們建議以指甲油固定蓋玻片以避免樣品風乾，塗指甲油前需先將溢出的封片膠擦掉，而塗抹時蓋玻片邊緣與載玻片都要確實塗到(如下圖)，才能確實達到固定與防漏的效果。用顯微鏡觀察前也務必確認指甲油已乾，以避免指甲油沾染到物鏡。

以指甲油塗佈於蓋玻片周圍，以固定蓋玻片避免滑動及避免樣品風乾，觀察前也務必確認指甲油已乾避免指甲油沾染到物鏡。

二、關於活細胞/活體樣品拍攝

    好的活細胞影像結果在論文發表時，其說服力有時更勝於固定細胞所得到的結果。但活細胞影像拍攝困難度往往大於已固定樣品種類，需要花費更多的時間與精力。因為要捕捉的通常是即時發生的變化以及反應發生的過程，需要考慮到的層面很多，例如樣品反應速度及存活性的問題，由於曝光秒數過長容易造成生物樣品光傷害而死亡，而反應速度越快需要的拍攝頻率也越高，相對的樣品暴露在光傷害的時間也增加，因此細胞所表現的螢光蛋白必須具有足夠的亮度與穩定性。在真正進行實驗組拍攝之前，需要先行測試拍攝條件，以提高成功率。

    活細胞影像的拍攝一般應使用倒立顯微鏡。由於細胞培養皿一般為塑膠底盤，使用塑膠底盤觀察細胞，首先要考慮的是塑膠的光線穿透率不如玻璃，其次是物鏡問題，20x物鏡以上需要塑膠底盤專用的長工作距離物鏡才能對焦(這類物鏡一般搭配在倒立顯微鏡上)，若要拍攝高倍率的清晰影像，則建議使用標準厚度玻璃底的培養皿，或是組合式培養裝置(可向本核心商借或是自行購買)，底部可裝置玻璃片，可視需要於玻璃片上進行如 polylysin的塗佈，細胞便可以種在玻璃片上。

三、全內反射螢光顯微鏡之樣品製作

    關於全內反射螢光顯微鏡之原理與應用，在第一期的電子報有詳細的介紹，在此不再贅述。全內反射螢光之拍攝，顧名思義所製備的樣品必須要使激發雷射能發生全反射才能擷取到影像，因此細胞必須處於水層中，如果是固定好的細胞就不能封片。此外，為了拍攝品質，細胞只能種在0.170mm±0.005的玻片上，或是更好的寶石片上。玻片於種細胞前切勿火烤以免變形而影響光的反射。   

    玻片上若是需要塗布介質以幫助細胞黏附，可能會造成高背景值(玻片表面螢光訊號增多)。若是細胞螢光標誌夠強，因為訊噪比的提高才可能拍攝出好品質的影像。此外，非緊緊貼覆生長於標準玻璃片上的樣品，由於漸逝波穿透距離的考量我們也較不建議使用全內反射螢光顯微鏡觀察。

一、上機前先鏡檢

    由於使用顯微核心的所有顯微鏡都要收費，因此使用前最好先在實驗室以顯微鏡檢查確定實驗成功後再來拍攝，以節省您寶貴的時間與金錢。另外在拍攝樣品前也應先以目鏡確認訊號標的細胞再拍照記錄，一開始未先透過目鏡鏡檢且急於透過電腦螢幕即時影像找細胞拍照的使用者，往往因為硬體調整錯誤而找不到影像，或拍攝到錯誤訊號。核心的顯微鏡開放給大家使用，前人的設定與之後的使用者不一定會相同，因此務必養成先用眼睛鏡檢找到細胞後再拍攝的習慣。

二、確認硬體狀況

    確認光源是否已開啟、穿透光或反射光路上的配件擺置是否正確無誤、鏡頭是否清潔等是拍攝樣品前一定要確實執行的步驟。依筆者經驗，最常發生的是鏡油沾染到乾式物鏡，鏡檢時會發現細胞影像模糊不清，影響拍攝結果，此時請將鏡頭以以棉花棒沾100% 酒精擦拭乾淨，或通知管理員擦拭鏡頭，並記錄於使用記錄本上，以幫助管理員提醒上一位使用者注意使用習慣。

    拍攝穿透光影像，尤其是DIC對比方式，務必要做聚光鏡克拉校正，目的在將聚光鏡光線聚焦在樣品上，以充分發揮物鏡及聚光鏡效能獲得最佳解析度的穿透光影像。使用者在拍攝前可請管理員幫忙校正或者向管理員請教學習如何做克拉校正。

    機器有任何狀況，或是使用者覺得與之前使用時有任何不同之處，請務必告知管理員處理，以維護所有使用者的權益。

三、玻片需擦拭乾淨

    讓來自於樣品的光線完全進入物鏡是獲得清晰影像的第一要務，玻片若是沒有擦拭乾淨上面沾有灰塵等，光線容易產生散射、折射或反射，因此來自樣品的光線

(例如樣品螢光)無法全數進入物鏡，使用油鏡時也容易污染鏡油，造成影像模糊。使用越高解析度物鏡及越靈敏的系統偵測光線時，這些微小細節卻是舉足輕重。

四、以穿透光記錄樣品外觀形態之重要性

    筆者發現使用者常認為穿透光影像與實驗結果無關，因此常省略不拍攝，殊不知穿透光影像可以清楚呈現細胞的型態，若是實驗過程中對生物樣品有任何不良影響，穿透光影像下的樣品外觀可當作很好的證據，這對老師判讀學生所挑選拍攝樣品位置是否有問題時有極大的幫助。而且投稿國際期刊有時可能會被要求要放入可見光影像，因此拍攝螢光影像時 我們建議同時拍攝可見光影像以供備用。